为什么需要内参
WB是蛋白定性和定量的金标准，常应用于研究生物样品中蛋白丰度的变化。由于WB检测包含多个步骤，样品制备、上样或转膜等实验过程中任何细微的差异，都可能导致实验结论的不一致，甚至完全相悖。为了避免实验操作差异引起的实验误差，在任何WB检测实验中，都需要设定合适的内参。
内参即内部参照（Internal Control），可以帮助确定样品间表达水平的差异，以判断是由细胞裂解物的实际蛋白水平导致，还是由上样量的差异导致，需要强调的是内参抗体应该与实验抗体在相同的印迹上进行。因此选择的内参蛋白必须是实验样本中稳定表达的蛋白，一般会选择组成型表达且是细胞基本功能必需的管家蛋白（Housekeeping Proteins），如细胞骨架蛋白等。内参蛋白有多种选择，随机选择β-Actin或α-Tubulin作为内参并不能满足所有的WB实验，寻找合适的内参是特定WB成功的关键。
内参抗体选择原则 1. 样本来源： （1）哺乳动物的组织或细胞样本：β-Actin、β-Tubulin、 GAPDH、 Lamin B1、PCNA、Histone H3等； （2）植物样本：plant actin、Rubisco等； （3）其他来源样本，参照已发表文献，选择合适蛋白作为内参。 2. 目的蛋白分子量： 选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小，一般保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5kDa以上。例如，目的蛋白分子量为40kDa，此时不适宜选择β-actin与GAPDH作为内参，可以考虑选择α-Tubulin或者β-Tubulin。 各内参蛋白分子量详见下表
3. 目的蛋白定位：
（1）细胞质蛋白：β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、GAPDH、Vinculin、Cyclophilin B等；
（2）细胞核蛋白：PCNA、Lamin A、Lamin B、Histone H3、K70、K80、Erk2、TATA binding protein (TBP)、c-Jun、c-Fos、YY1、HDAC1等；
（3）细胞膜蛋白：Na+/K+ ATPase等；
（4）细胞质膜蛋白：ATP1A1 (Sodium Potassium ATPase)等；
（5）线粒体蛋白：VDAC1、COXIV等；
（6）全血/血浆/血清：Transferrin、Albumin等。
4. 表达水平：
在特定实验条件下（如特殊的实验处理或不同的发育阶段），内参蛋白的表达水平相对于总蛋白需要保持恒定且高表达。常用的内参是由管家基因表达的，是细胞发育和维持细胞活力所必须的蛋白。例如，细胞核的内参蛋白PCNA，在DNA S期表达，因此对于非增殖细胞不推荐使用。
5. 丰度相似性：
实验样本中内参蛋白的表达丰度应与目的蛋白的丰度有相似性，实验方案和检测方法可以揭示内参蛋白和目标蛋白水平的变化，而不会出现信号饱和。如果内参蛋白的表达水平远远高于目的蛋白，必须对内参蛋白进行梯度稀释以确定内参蛋白的检测范围。
6. 表达因素：
（1）选择蛋白表达不受实验变量影响的内参，有研究表明，管家蛋白的表达有时并不恒定，会因实验条件的改变而改变。因此设计实验方案时应该考虑实际的实验因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意内参表达是否出现异常。
（2）在做多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用GAPDH作为内参，因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性。
（3）在某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。
（4）涉及细胞增殖的相关实验中，c-Jun由于自身表达变化不适合做内参。
（5）在做凋亡实验时，TBP、Lamin等不适合作为内参。
（6）做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，应选择结构蛋白作为内参，如β-Actin和β-Tubulin。
（7）做各种分泌液样本的时候，如血浆、乳汁、组织液等，由于没有完整的细胞结构，只能选择一些分泌蛋白作为内参。
7. 验证内参抗体质量：
（1）阳性对照实验：用已知表达的样本验证抗体有效性。
（2）梯度上样验证：内参条带强度应与上样量呈线性关系。
（3）多内参交叉验证：高分文章标配，比如同时跑β-Actin和 GAPDH。
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